高通量测序的数据处理与分析指北(一)--测序原理篇
原理介绍篇
前言
最近正在学习如何处理高通量测序的数据，我认为要处理高通量测序数，那么对测序原理要有一个清晰的认识，本篇文章介绍了sanger测序，二代测序的测序原理
1. sanger测序
要了解二代测序的优势，以及进步在何处，我们需要认识旧的测序方式的缺陷，从而深刻理解二代测序。
我们知道，在DNA合成时，是通过四个不同的碱基，按照模板链一一合成的， 而在sanger测序中，需要介绍一种特殊的碱基 —— ddNTP(双脱氧核苷酸)，ddNTP有四种类型：ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP，分别对应着四种碱基，他们跟正常的碱基不同点在于：ddNTP比正常碱基多脱一个氧，导致ddNTP之后不可以合成碱基，也就是ddNTP可以作为终止碱基参与DNA合成。知道这一点之后我们就可以开始讲sanger测序时DNA是如何合成的，且如何测序的。你也可以选择观看youtube的视频来了解。
- 首先你需要准备合成DNA的基本原料——四种碱基+模板链+测序对象的引物+其他必要酶及体系，这里我们假设你准备了四根管子，目前加入的原料均为上述材料，没有不同。
在加入试剂后，准备好合适的条件，DNA会开始解旋合成，因为DNA合成的随机性，并不能保证四根管子DNA合成的进度是同步的，甚至不能保证一根管子中的DNA合成是同步的
当合成反应进行一段时间后（注意不能是反应完成），分别向四根管子加入四种不同的ddNTP终止反应。此时，不同的四根管子，无论其中的DNA合成进行到那一步，其尾端的碱基我们都可以知道
然后将四个管子中的DNA半成品置入高精度电泳仪以判断他们的序列长度，然后我们就可以依靠序列的长度和其末端的碱基类型将其串连起来推导出原来的模板链序列了。
以上就是sanger测序的基本原理，从其测序原理上来看，sanger测序有这么几个问题：
- 测序需要自己合成引物，只能检测已知的基因。
- 测序通量较低
- 但是sanger测序可以一次性测出较长的序列，这是二代测序所不具备的
2. 二代测序
二代测序主要是针对sanger测序通量低。以及需要自己加引物，只能检测已知基因的这两个问题进行优化。二代测序通过一个方式解决了上述两个问题：将待测的基因序列接上自己设计的引物，这样不同的基因的引物会变为相同的引物。在进行PCR扩增等操作时，不需要对某个基因进行引物的定制。这一个过程就被称为基因文库构建。你可以通过**这个视频**来清楚的了解高通量测序的原理。下面是我自己的理解
因为DNA在复制时会出现随机错误的特性，目前的二代测序能保证高精度的检测长度大约是150bp，但是我们的基因，或者说编码基因往往不止150bp。甚至一些mRNA反转录出的cDNA的长度也超出了二代测序的最大精度。所以在进行二代测序前需要对检测的基因进行打断。下图描述了这一过程，将DNA或者cDNA打断为一些300-500bp的小片段。因为使用一些内切酶进行打断的，会出现两端不齐的问题，通过互补使其补齐。然后在尾部加上A-tailing是为了方便我们自己设计的引物可以接上序列，换言之A-tailing是为了让我们向序列中加入”接头“，这个”接头“后面会具体介绍到，其实就是包含引物和标签等内容的一小段小序列。
下面这张图就是接头序列的具体结构。
这些小片段接上接头后，我们的文库构建算是完成了。而这些小片段可以简单理解为read。一般来说，高通量测序检测的是mRNA。那么某一基因的read越多，那么就说明mRNA越多，基因的表达越强。这些read的数量就是高通量测序中的count数。显然，现在的最大问题是如何使我们可以检测到这些read的序列信息——ATGC排列，以便我们可以将其对比到基因上。在高通量测序中，使用的原理跟sanger测序类似，也是通过荧光的方法检测的。
高通量测序中使用的碱基是一种特殊的碱基，他的结构如下图：在没有加入洗脱剂（巯基试剂）之前，这个碱基是一个含有荧光基团和阻断基团的碱基，荧光基团在碱基上时，不显色。阻断基团在碱基上时，下一个碱基继续连接。因此高通量测序实际上时不断重复 加入四种特殊碱基延续DNA-加入洗脱剂-高精度拍照辩色确定碱基-加入四种特殊碱基延续DNA 这一过程。通过颜色的顺序就可以确定碱基的顺序。
然而这里会有一个问题——单独一个DNA片段的荧光表达量很细微，并不能检测到。因此需要通过桥式PCR进行扩增，将单独的DNA扩增成一群可以进行荧光检测的重复DNA，并且最好做到不同的DNA在不同的位置，且位置固定互不干扰。桥式PRC就可以做到这一点，桥式PCR和正常的PCR有一点不同。正常的PCR会将DNA扩增，而桥式PCR不但可以扩增DNA，而且扩增后的DNA往往会形成一个簇，来自不同模板的DNA会形成不同的簇。如下图。
在高通量测序中的桥式PCR，会通过在测序板上固定一些序列，这些序列的互补序列我们刚刚通过文库构建的步骤添加到了基因片段的两端，这些文库DNA分散在测序板的各个位置作为复制的模板，通过桥式PCR在附近形成一个簇（cluster）。桥式PCR的具体原理如下图。
本质上就是将DNA的一端固定，然后进行正常的PCR步骤，然后DNA会进行指数型的扩增。并且因为DNA固定，且序列较短，故往往会出现在附件进行复制的现象。最后形成一个cluster。高通量测序最后就是通过检测cluster的颜色判断序列信息，而这些cluster是一个read的复制，故也可以将这些cluster理解为read。
这里再重复一下read的序列信息是如何被检测出的，高精度的摄像头会对测序板进行背光拍照，测序板上的每个点表示cluster或者说是read。合成一个碱基 –> 对荧光基团进行洗脱，同时放出阻断基团，开放后续合成部分 –> 荧光发出亮光 –> 摄像头进行拍照，确定碱基 –> 合成下一个碱基。重复这个过程我们就得到了板上所有read的序列信息，且这个read上面是有index信息的，我们可以通过检查index信息对其进行编号等操作。
通过上述的步骤我们得到了一个已知序列信息的read，再重复一次，这些read是基因的片段，是不完整的基因。那么如何得到基因的表达量呢？因为打断是随机的，并且在做基因表达分析是用的往往是RNA反转录的cDNA为原料。因此每个基因被打断后的read数是跟基因的长度和基因的表达量（mRNA的数量）正相关。而mRNA的长度往往是在一个量级的，当两个基因表达量差距比较大时，可以忽略基因长度的影响。所以，我们再回到那个问题，如何获得基因的表达量？——答案是将read比对回基因，根据read的数量表示基因的表达量，这个read数量就是count数。